核酸計(jì)量技術(shù)為未來(lái)可能發(fā)生的公共衛(wèi)生緊急核酸檢測(cè)需求提供計(jì)量技術(shù)儲(chǔ)備，可以大大提升核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值準(zhǔn)確度，擴(kuò)展病毒核酸標(biāo)物的覆蓋范圍。

生命科學(xué)的量值以分子為最小單元，以物質(zhì)的量摩爾(mol)為基本單位，以阿伏伽德羅常數(shù)(NA)來(lái)計(jì)算，1摩爾是精確包含6.022 140 76×1023(約為6.02×1023)個(gè)原子或分子等基本單元的系統(tǒng)的物質(zhì)的量。從重新定義的國(guó)際單位制布局圖來(lái)看，我們可以看出物質(zhì)的量摩爾相對(duì)獨(dú)立。因此，在實(shí)際的生物計(jì)量研究中，一個(gè)核心的挑戰(zhàn)就是發(fā)展生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)生物檢測(cè)過(guò)程與國(guó)際單位的量值溯源。

生物計(jì)量

生物計(jì)量是計(jì)量科學(xué)領(lǐng)域的新成員，最早的生命科學(xué)研究?jī)H限于現(xiàn)象和趨勢(shì)的觀察，最常回答“是什么”的問(wèn)題。然而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物定量測(cè)量變得越來(lái)越重要，大家開(kāi)始關(guān)注“有多少”。目前，準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品安全和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域，與人類的生產(chǎn)生活密不可分。此外，生命科學(xué)相關(guān)技術(shù)的推廣應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展催生了大量的計(jì)量需求：技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)品質(zhì)量、儀器校準(zhǔn)等。總體來(lái)說(shuō)，如何結(jié)合計(jì)量科學(xué)的應(yīng)用進(jìn)行生物的準(zhǔn)確測(cè)量是擺在計(jì)量研究人員面前緊迫而艱巨的工作。

生物計(jì)量學(xué)早在1999年第21屆國(guó)際計(jì)量大會(huì)就被提上日程。隨后，物質(zhì)的量咨詢委員會(huì)(CCQM)成立了生物分析工作組(BAWG)。該工作組的主要任務(wù)是建立生物技術(shù)可溯源測(cè)量系統(tǒng)，優(yōu)先考慮的是核酸測(cè)量、蛋白質(zhì)測(cè)量及其方法、分析過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，以便鞏固核酸和蛋白質(zhì)測(cè)量的應(yīng)用領(lǐng)域。核酸計(jì)量是生物計(jì)量研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，是為了支持核酸測(cè)量的可比性、有效性和溯源性，最終使測(cè)量可溯源到國(guó)際單位制。目前，國(guó)際上從事核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的機(jī)構(gòu)主要有美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(NIST)、歐盟委員會(huì)聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究院(IRMM)、英國(guó)政府化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(LGC)、德國(guó)聯(lián)邦材料測(cè)試研究院、澳大利亞國(guó)家測(cè)量院等。核酸計(jì)量的發(fā)展在中國(guó)同樣引起了很大的關(guān)注。中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院組建生物計(jì)量研究團(tuán)隊(duì)，取得豐碩的研究成果，多次參與或者主導(dǎo)國(guó)際核酸計(jì)量比對(duì)工作。上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院(以下簡(jiǎn)稱“上海計(jì)量院”)等計(jì)量機(jī)構(gòu)則以地方產(chǎn)業(yè)需求為導(dǎo)向，搭建具有特色的核酸計(jì)量研究平臺(tái)。

上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院

病原微生物核酸檢測(cè)是預(yù)防病原微生物侵害，應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生事件的關(guān)鍵防線，而核酸濃度計(jì)量溯源是確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的根本依據(jù)。當(dāng)前，雖然以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表的核酸檢測(cè)方法發(fā)展迅速，但是完整的計(jì)量溯源體系仍有欠缺，表現(xiàn)為缺乏高水平絕對(duì)定量方法、尚無(wú)病原微生物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、尚依賴發(fā)達(dá)國(guó)家進(jìn)口、儀器計(jì)量校準(zhǔn)和試劑盒質(zhì)量控制受到阻礙等。總之，病原微生物核酸濃度量值在溯源到國(guó)際單位制(SI)的時(shí)候困難重重，影響了公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域核酸檢測(cè)的可靠性。

核酸計(jì)量溯源

核酸測(cè)量結(jié)果計(jì)量溯源是生物計(jì)量學(xué)科的一個(gè)重要領(lǐng)域，其目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)核酸濃度量值與國(guó)際基本單位的鏈接，確保每一個(gè)核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠和等效一致。病原微生物核酸檢測(cè)在公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有重要作用，可是長(zhǎng)期以來(lái)，微生物核酸檢測(cè)領(lǐng)域的質(zhì)量控制依賴定性標(biāo)準(zhǔn)樣品居多，而定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)非常少，并且由于核酸計(jì)量溯源整體研究水平的限制，缺乏高準(zhǔn)確度核酸定量參考測(cè)量方案，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也存在不確定度較大的問(wèn)題。由于不確定的累計(jì)原理，最終會(huì)影響公共衛(wèi)生測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

● 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

分子生物學(xué)技術(shù)為我們提供了分子制造手段，又通過(guò)高準(zhǔn)確度的參考定值方法，我們能夠獲得可靠的濃度量值，從而可以構(gòu)建最高的生物計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。例如，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種含有檢測(cè)目的基因的特異性片段的重組質(zhì)粒分子，在PCR定性檢測(cè)中可以作為陽(yáng)性對(duì)照，在定量PCR中可以作為定量分析的標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在上海計(jì)量院，質(zhì)粒DNA的定值采用了3種方法以保證其量值的準(zhǔn)確性：紫外分光光度法、高分辨率電感耦合等離子體光譜分析(HR-ICP-MS)法、數(shù)字PCR技術(shù)。將這3種方法聯(lián)合起來(lái)給質(zhì)粒DNA定值，可有效保障標(biāo)準(zhǔn)量值準(zhǔn)確度性、溯源性。上海計(jì)量院先后研制了30種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中有5種是國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2020年，新型冠狀病毒肺炎疫情給核酸檢測(cè)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。新型冠狀病毒核酸分析以病毒RNA為測(cè)量目標(biāo)，通過(guò)核酸含量檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床判斷，其準(zhǔn)確性對(duì)疫情防控具有重要意義。作為一種特殊的測(cè)量器具，必須通過(guò)計(jì)量溯源來(lái)確保其必要的測(cè)量能力。GB/T 21415—2008(ISO 17511)對(duì)體外診斷技術(shù)(試劑和器械)在測(cè)量生物量的過(guò)程中所涉及的計(jì)量學(xué)溯源性做出明確的說(shuō)明：為了使檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)量的測(cè)量得到正確的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，不論在何時(shí)何地都具有可比性，量必須有明確的定義，報(bào)告給醫(yī)生或者其他衛(wèi)生人員及患者的結(jié)果必須準(zhǔn)確(正確和精密)。

● RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

為了給病毒核酸檢測(cè)提供可靠的計(jì)量支撐，上海計(jì)量院在上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)支持下，在上海市市場(chǎng)監(jiān)督管理局協(xié)同指揮下，與上海交通大學(xué)及其附屬仁濟(jì)醫(yī)院優(yōu)勢(shì)學(xué)科力量合作，啟動(dòng)了新型冠狀病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)項(xiàng)目，研究高準(zhǔn)確度RNA數(shù)字PCR絕對(duì)定量方法，研制了兩種“新型冠狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)091111/091112”，以新型冠狀病毒E、N和ORF1ab三個(gè)基因?yàn)槟繕?biāo)，涵蓋世界衛(wèi)生組織(WHO)和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)公布的關(guān)鍵檢測(cè)區(qū)域，利用體外轉(zhuǎn)錄方法制備，采用數(shù)字PCR方法對(duì)新型冠狀病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定。這兩個(gè)國(guó)家級(jí)病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以為病毒RNA檢測(cè)方法研發(fā)提供靶標(biāo);可以直接用于質(zhì)量控制，對(duì)核酸試劑盒靈敏度、線性范圍以及靶向基因區(qū)域等進(jìn)行確認(rèn);也可以為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供RNA陽(yáng)性伴隨樣品，預(yù)警假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，為病毒RNA檢測(cè)提供量值溯源的“砝碼”。截至目前，這兩個(gè)國(guó)家級(jí)病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)向全國(guó)120多家單位提供樣品1300余份，為疫情防控作出多方面貢獻(xiàn)，具體體現(xiàn)在以下5個(gè)方面。

第一，助力海關(guān)把好“國(guó)門”。根據(jù)2020年4月9日上海市新型冠狀病毒肺炎疫情防控科技攻關(guān)組會(huì)議精神，為支撐海關(guān)入境特殊場(chǎng)景需求，應(yīng)海關(guān)衛(wèi)生中心要求，上海計(jì)量院研制RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100份，成為海關(guān)篩選合格試劑盒標(biāo)準(zhǔn)，提升了核酸檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠性，為防止境外輸入漏檢提供了計(jì)量支撐。

第二，RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)供給疾控、臨檢中心以及醫(yī)院檢驗(yàn)科作為陽(yáng)性質(zhì)控，驗(yàn)證核酸檢測(cè)結(jié)果可靠性。目前的應(yīng)用單位有武漢市疾病預(yù)防控制中心、安徽省疾病預(yù)防控制中心、江西省疾病預(yù)防控制中心、重慶市臨床檢驗(yàn)中心、上海市東方醫(yī)院吉安醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)、中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院等。

第三，在疫情發(fā)生第一時(shí)間為15所科研機(jī)構(gòu)提供新型冠狀病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為檢測(cè)新方法建立提供了靶標(biāo)，支撐國(guó)家和上海防疫科技專項(xiàng)，服務(wù)清華大學(xué)、上海交通大學(xué)、湖南大學(xué)等高校。例如，湖南大學(xué)譚尉泓院士團(tuán)隊(duì)成功建立了RNA分析方法并將成果輸出國(guó)外，對(duì)上海計(jì)量院研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)給予高度評(píng)價(jià)。此外，上海計(jì)量院與上海仁度生物科技有限公司合作承擔(dān)上海科委專項(xiàng)，研發(fā)唯一獲批的RNA高通量檢測(cè)方法。

第四，支持全國(guó)83家試劑盒生產(chǎn)企業(yè)，利用我院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為生產(chǎn)線的標(biāo)準(zhǔn)樣品賦值，從而滿足GB/T 21415要求，實(shí)現(xiàn)了試劑盒的計(jì)量溯源，提速試劑盒的注冊(cè)，在試劑盒生產(chǎn)管理過(guò)程中作為核查標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證產(chǎn)品質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值傳遞范圍覆蓋90%現(xiàn)有核酸試劑盒生產(chǎn)企業(yè)，如上海之江生物科技股份有限公司和上海捷諾生物科技有限公司。

第五，疫情期間，上海計(jì)量院為200家生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室以及試劑盒生產(chǎn)企業(yè)提供計(jì)量器具校準(zhǔn)服務(wù)，如針對(duì)PCR反應(yīng)儀、微量核酸蛋白定量?jī)x、生化分析儀、電解質(zhì)分析儀、多功能酶標(biāo)儀、尿液分析儀、流式細(xì)胞儀等。上海計(jì)量院還為多家疾控中心提供新型冠狀病毒核酸檢測(cè)儀器校準(zhǔn)，確保核酸檢測(cè)一線實(shí)驗(yàn)室結(jié)果計(jì)量溯源。此外，上海計(jì)量院為多家試劑盒企業(yè)開(kāi)展PCR校準(zhǔn)服務(wù)，為上海地區(qū)企業(yè)的產(chǎn)品緊急注冊(cè)提供關(guān)鍵計(jì)量溯源支撐。

上海計(jì)量院團(tuán)隊(duì)還將持續(xù)開(kāi)展病毒核酸計(jì)量溯源技術(shù)研究，擴(kuò)展分子長(zhǎng)度，提升靶向適用性;發(fā)展并優(yōu)化高準(zhǔn)確度絕對(duì)定量方法，提升核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值準(zhǔn)確度;擴(kuò)展病毒核酸標(biāo)物的覆蓋范圍，為未來(lái)可能發(fā)生的公共衛(wèi)生緊急核酸檢測(cè)需求提供計(jì)量技術(shù)儲(chǔ)備。

許麗，上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院高級(jí)工程師，主要從事核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制工作。

梁文，上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院高級(jí)工程師，主要從事核酸分析測(cè)試、數(shù)字PCR分析工作。

劉剛，上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事生物計(jì)量、生物傳感研究工作。