山東出入境檢驗檢疫局　高宏偉  劉心同  陳世山  丁士兵  昃向君　中國計量科學研究院  施昌彥

　　一、目標

　　按ISO21570(Foodstuffs-Detection of genetically modified organisms and derived products-Quantitative nucleic acid based methods)測定大豆樣品中轉基因大豆含量定量檢測的不確定度。
　　本課題是對動植物檢驗檢疫領域定量檢測項目進行不確定度評定的嘗試。    

　　二、測量程序

　　1.DNA提取
　　大豆DNA的提取，按照國際標準草稿ISO/DIS 21571(Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -Nucleic acid extraction)進行。

　　2.定量檢測
　　(1)陽性參照標準品的設立(可任選其一)。
　　(2)將轉基因大豆標準物質(%)的DNA，調整至相同濃度(ng/μL)，作為定量反應的模板。
　　(3)對含有待檢外源基因和內源基因的陽性質粒DNA，將其濃度調整為相同體積含有不同DNA拷貝數(如:0、10、100、1000、10000拷貝/5μL或0.01、0.1、1、10、100pg/μL的DNA)，作為定量反應的模板。
　　(4)實時熒光PCR反應體系。
　　實時熒光PCR反應體系見表1，引物序列按ISO21570的規定。
    

　　(5)實時熒光PCR反應參數。
　　實時熒光PCR的反應參數為:50℃/2min；預變性95℃/3min；95℃/15s，60℃/1min，40個循環。

　　(6)上機運行。
　　按預先設定的樣品擺放順序，依次擺放PCR反應管，在樣品名輸入處編輯實時熒光PCR反應參數并開始運行儀器。運行結束后分析并保存數據。

　　(7)基線的設置和數據記錄。
　　反應結束并分析結果后，應設置無效基線范圍。無論采用哪條熒光通道(FAM或TET)，基線范圍選擇在3～15個循環，閾值設置原則上以基線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，且以Ct值等于40為準。

　　(8)使用質粒作為定量檢測參照物的結果計算。
　?、倮L制標準曲線和推導回歸方程
　　根據標準物質中含有的作物內源基因和外源基因的量，以及所得Ct值之間的對應關系，分別以Ct值為縱坐標，以內源基因或外源基因量的對數為橫坐標，擬合標準曲線并可分別得到內源基因或外源基因的線性回歸方程。
    
　　式中:A——樣品中內源基因或外源基因的量；Ct——樣品的Ct值；k——標準曲線在y軸的截距；m——標準曲線的斜率。
　　②待測樣品中轉基因成分含量的計算
　　將所測得的待測樣品外源基因或內源基因的Ct值代入各自的回歸方程，計算出樣品中內源基因或外源基因的拷貝數。根據公式(1)計算樣品中轉基因成分的百分含量。
    
    式中:C——樣品中轉基因成分的百分含量，%；A_外——樣品中外源基因的量；A_內——樣品中內源基因量。    

　　三、檢測結果(如圖1所示)

    圖1  檢測結果

　　對1個含轉基因大豆的大豆樣品做7次平行測定，結果見表2。
    

　　四、數學模型

　　
　　式中:C——樣品中轉基因成分的百分含量，%；Ct——樣品中外源基因或內源基因的Ct值；k——標準品中外源基因或內源基因的標準曲線在y軸上的截距；m——標準品中外源基因或內源基因的標準曲線的斜率。    

　　五、不確定度來源(如圖2所示)    

    圖2  樣品測量不確定度來源因果圖

　　六、標準不確定度評定

　　1.A類標準不確定度評定
　　A類不確定度由各類隨機效應引起，計算如下:
　　
    

　　2.B類標準不確定度評定
　　(1)標準曲線讀數Ct值的標準不確定度
　　標準系列樣品的測量值和計算數據如表3和表4所示，用最小二乘法計算曲線方程。
    

    在樣品實際檢測中，標準曲線只做1個重復，在測量點A_外=0.031和A_內=0.845處，Ct_外=30.340和Ct_內=25.040(平均值)，由標準曲線引入的標準不確定度分量計算如下:
    在試樣的測量次數p=1時，最小二乘法引入的不確定度分量為:
    
    式中:s(1gA)——由標準溶液Ct值殘差計算的標準差；n——標準溶液的測定次數；lgA₀——實測點濃度的對數。
    
    故其相對標準不確定度為:
    
    內源基因標準曲線的不確定度u(Ct內)分量為:
    
    故其相對標準不確定度為:
    
    標準曲線的不確定度是用統計原理計算得到的，其自由度為n-2。所以:
    

　　(2)移液槍的標準不確定度
    移液槍造成的不確定度呈均勻分布。
    移液槍在其測量范圍(10～100)μL(V₀)內的最大允差為±0.1μL，由此帶來的標準不確定度(μL)。使用的加樣體積為12.5μL，故其相對標準不確定度為u_rel1=0.0577/12.5=0.0046。
    移液槍在其測量范圍(0.5～10)μL(V₁)內的最大允差為±0.02μL，由此帶來的標準不確定度u₂=0.02/=0.0115(μL)。使用的加樣體積分別為2μL、2μL、8.2μL，故其相對標準不確定度分別為u_rel2=0.0115/2=0.0057、u_rel3=0.0115/2=0.0057、u_rel4=0.0115/8.2=0.0014。
    移液槍在其測量范圍(0.1～2.5)μL(V₁)內的最大允差為±0.002μL，由此帶來的標準不確定度u₃=0.002/=0.0011(μL)。使用的加樣體積為0.3μL，故其相對標準不確定度為u_rel5=0.0011/0.3=0.0036。
    考慮到各范圍測量的獨立性，移液槍允差帶來的合成相對不確定度為:
    
    標準不確定度以最大偏差估計，其自由度可取為無窮大，即ν₃=ν₄=ν₅=∞。

　　(3)B類標準不確定度的合成
    B類不確定度各分量u_rel外，u_rel內，u_rel槍相互獨立，所以其靈敏系數均為1，u_rel外，u_rel內，u_rel槍合成為B類合成標準不確定度u_ref:
    

　　3.合成標準不確定度評定
　　考慮到A類標準不確定度和B類標準不確定度相互獨立，則
    
    

　　七、擴展不確定度評定和報告

　　U=k×u_c，包含因子k為置信水準p=95%、自由度ν=6的t分布臨界值，按非整ν內插計k=2.45，故U=2.45×0.5201%=1.3%。
　　測量結果C%=3.73%±1.3%，其中1.27%是擴展不確定度U，它取決于合成標準不確定度u_c=0.5201%和包含因子k=2.45，k的值基于置信水準p=95%、自由度ν=6的t分布。

　　致謝:本文得到了國家質量監督檢驗檢疫總局課題《食品安全實驗室質量管理、技術運作和評審認可體系的研究》(2003IK037)的資助。